荧光分子标记生物大分子最主要优点是能够进行实时检测。荧光标记蛋白(抗体)被广泛用于生物活体示踪,免疫荧光等领域。由于传统荧光(FITC,HAM 等)标记的灵敏度低,荧光标记蛋白用于电泳与电泳相关技术的很少。随着技术的进步,近红外荧光标记大分子被发现能够大大提高检测灵敏度,使之达到与放射性同位素或化学发光(ECL)技术相当的灵敏度水平。荧光标记抗体逐渐被用于Western Blotting 领域,但与ECL Western Blotting 技术相比,并不能节省时间与操作步骤,仍需一天的时间出结果,省掉的只是最后冲印胶片或ECL成像的。比较而言,近红外荧光EMSA的优点非常突出当使用近红外分子标记的EMSA探针,EMSA变得非常简单,快速。
传统用放射性同位素标记探针的EMSA需要5到6天出结果,天天都要与射线打交道。基于地高辛标记的非放射性EMSA需要3天左右出结果。微奥基因的生物素标记探针的EMSA测定(湿转膜,联系我们索取资料)可在8小时左右出结果。以后再经过我们科学家改进,生物素标记探针的EMSA(半干转膜,联系我们索取资料)可在4个时左右完成。近红外EMSA测定技术可使EMSA测定在2小时左右完成,不仅快,关键是操作非常简单(查看比较几种不同EMSA方法),使之成为远比Western Blot测定磷酸化信号分子或免疫荧光更为简便有效的测定转录因子活性的技术。近红外荧光EMSA的优点包括:
1) 非放射性。 2) 操作十分简单,整个操作只相当于跑一次垂直板凝胶电泳。
3) 不需要暗室。
4)不需要胶片冲洗设备与化学品耗材。
5)出结果快(2小时左右)。
6) 适合定量分析。
进行近红外荧光EMSA需要以下试剂与设备:
A. 需要近红外荧光扫描仪。采用荧光标记探针的非放射性EMSA一直有人试,但无法解决灵敏度低的问题。Li cor公司开发的近红外荧光技术与相应仪器辉快了长期困扰的灵敏度问题。做近红外荧光EMSA需要使用Li Cor公司的近红外扫描仪(Odyssey)。国内很多大学与科研院所都已经有了Li Cor 的红外荧光扫描。我们建议有打算做EMSA测定的客户去问一问所在单位有没有共享的Li Cor 扫描仪,毕竟进行红外荧光EMSA方便快速很多。
B)需要近红外荧光探针。在已经有Odyssey近红外扫描仪的单位进行近红荧光标记的EMSA还是有相当困难。一是在国内没有任何一家应用LiCor公司的lRDye700/800进行核酸探针的公司。即使使用替代近红外荧光(如CY5.5等)来标记探针,国内外的价格较生物素标记贵近4-5倍。例如,5 OD的探针,DNA合成公司对生物素标记的收费为300-500元/链,地高辛标记400-600元/链。而用CY5.5标记DNA链的价格为1500-2000元/链(生工网上显示收费1500元,宝生物为2200元)。因为EMSA探针为双链,实际合成探针的费用还要X2,再加上合成Olig的费用。仅仅合成带近红荧光寡核苷酸的费用就在4000元左右,还不包括后面双链制作,纯化以及比活性测定。这样的费用使一些用户望而却步,宁可采用相对较便宜的生物素(化学发光)标记探针的EM
微奥基因公司已经有数十种近红外荧光标记的EMSA探针以优惠价格(查看荧光探针目录)出售,并可以为客户定制个性化近红外荧光EMSA 探针。
C)电泳设备。近红外荧光EMSA 需要垂直板蛋白电泳装置。对电泳装置没有特别要求。如果电泳装置曾经被用于Western Blotting,必须清洗,侵泡几天。EMSA测定的所有液体,试剂与装置都不能有SDS。
D)近红外荧光探针与样品反应结合液(微奥基因的成套试剂已包括)。
E)样品上样液(微奥基因的成套试剂已包括)。