EMSA试剂选择

  
  

初次接触EMSA的客户可能出现EMSA试剂选择困难。网上常看到有”如何选择EMSA试剂“的求助。Viagene团队对EMSA技术有丰富经验,对市场情况非常了解,以下意见供参考。

【A】选用EMSA试剂盒的一般原则。

1. 产品的成熟程度:产品在市场上有多少时间,有多少人用过。
2. 是否有完整EMSA产品链:做EMSA需要各种相关试剂。如果服务商本身都没有条件做EMSA,可以认定所出售的
     EMSA试剂盒根本没经过检验。
3. 了解公司的技术力量:购货前可联系商家问些EMSA技术问题。如果商家的相关知识没有客户多,Forget it !!!
4. 了解用户满意度:有多少人用过,满意度怎么样。
5. 是否有与产品相关的文章发表:尽管没有文章不能证明产品好坏,但有相关文章发表肯定对试剂选择有加分。
6. 不要混用几家公司产品:因为 1)不同厂家的产品成分与配方各有不同,混合使用很可能不工作。2)会导致难于找出EMSA遇到的问题。3)如果结果不理想,都不知道向那家公司求助。

例如,某位客户所用的样品是鼠脑组织,EMSA试剂盒是碧云天的,核蛋白提取是Thermo的,探针序列是网上找的,Oligoes是生工合成,双链探针是自己做的,用的是Minipore Hypond膜,做实验没有阳性样品对照。如果客户测不出结合带而求助,我们难提供有效帮助。

【B】EMSA产品比较。下表列出了市场上各种非放射性(发光)EMSA的优缺点,供参考。市场上天恩泽的“即用型EMSA试剂盒”与碧云天的"EMSA/Gel-Shift试剂盒"实际为放射性探针标记的试剂,而不是EMSA测定试剂,故未收编。

   LightShift DIG-EMSA EMSA kit 发光EMSA CoolShift 完全EMSA 完全EMSA+
生产厂商  Thermo Roche Signosis 碧云天 Viagene
结合反应液 2
Poly[dI: dC] 1
Poly[dA: dT] 1
Poly Lysine 1
抗DIG抗体
DIG标记Kit
上样液
亲和素-HRP
发光底物 HRP AKP HRP HRP HRP HRP HRP
膜封闭液
膜洗液
HRP平衡液
生物素探针
专用转运膜
MgCL28 2 10 10
KCL8 2 10 10
NP408 2 10 10
Glycerol8 2 10 10
EDTA8 2 10 10
BSA8 2 10 10
质控标记探针 3 4 5 5
竞争探针 option option
突变探针 option option
质控蛋白 6 7 option option option
阴性对照9 option option option
阳性对照9 option option option
EMSA预制胶 option option option
EMSA电泳液 option option option
测定样品数 100 100 30 100 100 30/50 30/50
价格 ~5000 ~4500 ~7000 1399 1799 1942/2895 2442/3395
1. Roche 通过Poly[dI: dC]、Poly[dA: dT]与Poly Lysine的用量来控制DIG EMSA的背景与结合带强弱。生物素与荧光EMSA通常是通过Poly[dI: dC] 与优化剂8用量来控制EMSA的背景与结合带强弱。
2. 碧云天将Poly[dI: dC]混合到反应液并不提供优化试剂8会引起很大问题。因为做EMSA一开始都可能看不到或看到很弱的结合带,需要调整Poly[dI: dC]与优化剂用量才能达到良好结果。使用碧云天试剂不能对测定条件做任何调整。
3-5. Thermo试剂配EBNA探针与EBNA6,Roche配OCT2A探针与OCT2A做试剂质控7,与客户样品的测定条件没有关系。Viagene的质控探针带多个看家基因结合位点,能够与客户的核提取产生结合带,除了用作试剂质控,还能直接确定客户样品质量。
9. Viagene供应数十种与客户待测转录因子相同的阳性/阴性对照。
10. 有关成分已经整合到特定转录因子的反应液中。测定条件已经确定,不需要客户再做优化。

【C】市场产品点评。

1. 关于Thermo的LightShift试剂盒

优点 -- 1)非放射,生物素/ECL系统,灵敏度高,2)适用于未NFkB_bufs知结合条件转录因子测定,3)试剂量大,4)稳定,5)带EBNF阳性对照*
缺点 -- 1)价格贵,5000+元/套。2)非即用型;客户需制备或另购探针。首次接触EMSA的客户自己设计制作的探针可能不工作。3)需摸索测定条件,会花费额外时间与钱财。以NFkB为例,用选配试剂做EMSA会出现多种结合带型(右图),结果难于判断。4)不带转运膜,客户需另购。常用的NC、PVDF与尼龙膜很可能做不出结果。 5)EBNF对照意义不大(下面解释)。6)在国内难于获得有力技术支持。
*EBNF对照用处不大,因为 1)EBNF分子很小,难于用作标准判断样品结合带位置。2)EBNF反应条件与实际样品非常不同。EMSA失败一般是由于核蛋白丢失、蛋白降解、蛋白因子未活化、探针不结合或实验条件受限等原因,但与EBNF有无结合没有关系。3)理论上,测不出EBNF带可能提示 电泳、转膜、紫外交联、酶反应、洗膜或ECL底物等环节出了问题。实际上,如果电泳、转膜、紫外交联、酶反应、洗膜或ECL底物等任何环节出问题,游离探针也就会看不到,因此,并没有非用EBNF对照的理由。4)实际上、用于发表的图是不会有EBNF带的,有也需要裁剪掉。

2.  关于Roche地高辛(DIG)标记EMSA试剂盒

优点 -- 1)非放射性,2)适用于未知结合条件的TF测定,3)试剂量大,4)稳定,5)带OCT2A阳性对照*
缺点-- 为最早的非放射性EMSA试剂,但与后来开发的生物素/荧光EMSA相比,已没有任何优势。1)非即用型试剂盒,到货后要标记探针,配制膜洗液与购买转运膜等。2);7000多一套,比任何EMSA试剂盒都贵。 3)工作量大;DIG标记手工进行,标记率低。相比之下,生物素/红外荧光标记在机器合成核酸时进行,与订购引物一样简单。 4)费时;手工标记探针需要两天时间。此外、DIG发光检测是基于半抗原/抗体反应,亲和性低,需要2天才能见到结果。而生物素/亲和素的结合比抗原/抗体强万倍,~5小时左右就能出结果。近红外荧光EMSA更将检测时间缩短到~2小时。5)背景高;DIG的抗原/抗体反应只能在温和条件下孵育。相比之下,生物素/亲和素结合能经历严苛的孵育与洗涤条件,图谱更漂亮。 6)灵敏度低;DIG系统使用碱性磷酸酶(AKP)系统(说明书要求曝光15-30分钟),其灵敏度远不如HRP(曝光1-5分钟)。如果使用成像仪,AKP的结果很难看到。 5)国内很难获得技术支持。

3. 关于Signosis EMSA试剂盒

优点 -- 1)非放射性生物素/ECL系统,灵敏度高。2)带探针与膜的即用型。
缺点 -- 1)价格贵,4500元/30次测定。2)选择有限,无法进行个性化或SNP测定。3)国内很难获得技术支持。

4. 关于碧云天化学发光EMSA试剂盒

优点 -- 1)非放射,生物素/ECL系统。2)价格低。
缺点 -- 1)非即用型,需要客户自己设计/制作 或 购买AP1_buf_compare针(探针问题解释)。2)客户需另购转运膜,常用的NC、PVDF膜等拿不到好结果。3)Poly[dI: dC]与反应液配为一体以及所有TF结合都使用单一反应液而不配优化试剂,是该产品最大的问题。因为做EMSA预实验时,可能看不到或看到很弱的结合带,常常需要调整Poly[dI: dC]用量与优化试剂成分才能获得良好结果。但碧云天EMSA试剂盒不能对测定条件做任何调整。以常见的NFkB(右上图)与AP-1 (右图)EMSA为例,相同样品与探针在不同反应液做EMSA结合反应,所测得的EMSA结果有很大差别。例如,两图中的第3泳道使用相同反应液,在AP-1图中看不到结合带(右图最上带),但在NFkB图中出现高背景(右上图最上带为NFkB带)。很明显,使用单一反应液并不能调整反应条件,很可能导致失败、信号弱、或出现无法解释的结果。进一步把单一反应液用于成千上万种转录因子/结合蛋白测定,问题会更加严重。的确,有不少碧云天用户在网上反映做不出EMSA结果(QQ197845171 :EMSA专题讨论)

Poly[dI: dC]用量对转录因子结合的影响在分子生物学圣经 “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” 有详细介绍。实际操作中,不管是我们做技术服务还是客户自己做的EMSA测定都需经过一定优化。

5. 关于Viagene EMSA试剂盒

Viagene 不像Thermo、Roche、Li Cor 那样有名。但我们聚焦于转录因子活性检测这一领域,所提供的相关产品类别最全、数量最多(产品列表)。产品线涵盖了测定未知反应条件蛋白因子的通用型以及针对特定转录因子测定的即用型成套试剂(比较上面表格)。Viagene的EMSA试剂盒对所测定的TF已经预实验确定了测定条件,成功率高,价格有竞争性。地表上没有哪家公司能够提供种类繁多的阳性转录因子对照,以及种类繁多的近红外荧光EMSA产品。

从测定灵敏度与易操作考虑,Viagene的EMSA产品没有基于DIG的测定系统。Viagene不会提供单一反应液以及不能调整Poly[dI: dC]用量的EMSA产品。大量文献以及我们的实验证实转录因子与DNA的结合在不同反应液中有明显差别。实际上,许多客户正是通过调整反应液成分以及Poly[dI: dC]用量而获得成功的。

Viagene 提供各种转录因子活性检测的技术服务(服务列表),使用我们产品与服务而发表文章有上千篇

我们的技术支持一流,QQ:2941312161与微信:viagene 24小时开放。

【D】EMSA相关产品的选购(详情

 

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