• 一、为什么需要EMSA阴性阳性对照

  

• 通过电泳技术确定目标分子位置时，一般都会放分子量参考物。Western Blotting （WB）使用蛋白分子量Marker，DNA/RNA电泳使用DNA/RNA 分子量Markers 来确定目标分子的位置。 在蛋白与核酸电泳分析中不用Marker会导致无法确认目标分子。同样，在EMSA测定中，不用参照物会造成结果分析困难。

• EMSA是用非变性胶来分析天然蛋白迁移率。在非变性胶中的蛋白迁移率受许多因素影响；

1）蛋白分子量大的移动慢。但由于EMSA的PAGE 胶浓度很低（相对于WB的浓缩胶），对大蛋白的分离远不及WB。
2）天然蛋白质的3D构型会影响电泳迁移率；小的丝状蛋白可能比分子量大很多的球形蛋白移动慢。
3）蛋白质所带电荷的极性与强弱会影响电泳迁移率; 带负电荷多的移动快。
4）蛋白与蛋白结合会迁移率；如多数转录因子都需与别蛋白结合而发挥作用。
5）蛋白与不同类型探针结合迁移率会有差别。非放射性标记探针的标记物也会影响目标蛋白迁移率。

• 二、如何制备或获得EMSA对照

• 做EMSA的目的不是用来判断目标蛋白大小，而是找出核酸/蛋白复合物的位置。因而，在EMSA胶中放分子量Marker没有用，也不能WB的Marker。 一般会在实验时，同时进行EMSA阴性阳性对照的结合反应，一起跑电泳。制备EMSA对照，尤其阳性对照，可以参照文献，采用大家公认的方式进行并且经过EMSA确认。

  以我们做的NFkB对照为例，阳性对照的制备如下；培养Mo7e细胞3天左右，头天放无血清培养基过夜，第二天上午用肿瘤坏死因子（TNF-a）处理1小时，然后抽提核蛋白， 测定蛋白浓度，做NFkB的EMSA分析。阳性样品分装后放-80oC保存。即使这样处理，仍然有25%的几率，NFkB的EMSA结果为阴性，可能与细胞生长有关。

  三、如果选择EMSA对照

  （1）如有可能，尽量选用与实验蛋白因子相同的EMSA对照，有以下好处；1）能够准确指示目标带的位置，2）使用相同探针有助于确定实验条件，3）容易找出EMSA测定中的问题，4）带阴阳对照的图谱可以一起发表。

  （2）当制备与实验蛋白因子相同的对照不易或不可行时，也可采用以结合蛋白位置相近的已知阳性结合蛋白做对照（实际上，WB与核酸电泳中的分子Marker都实验样品不同）， 但阳性对照与实验样品的物种来源不要差别太大。对动物与人的许多转录因子而言，阳性结合带都会出现在特定区域，许多都可以互作对照。如果客户对位置判断有问题，微奥基因可以协助解决。

  （3）如果阳性对照的结合带位置与EMSA目标分子差别很大，作为阳性对照的意义不大。Thermo公司的Lightshift 中的EBNF阳性对照就没有什么实际意义；

  1）EBNF结合带位置比非特异结合带都低，位于游离探针上面一点，不能帮助判断绝大多数DNA/RNA结合蛋白的位置。
  2）EBNF对照所用探针与样品与实验测定完全不一样。EMSA实验结果未达预期可能是由于核蛋白丢失，蛋白降解，蛋白因子未活化，探针不结合等原因，但与EBNF对照有无结合带出现半毛钱关系都没有。
  3）在同一片胶中用EBNF对照的理由是可确定电泳与测定系统是否工作。理论上，如果跑电泳，转膜，紫外交联，Biotin/Avidin反应，或ECL底物出问题，就可能看不到EBNF结合带。但实际上，出现上述问题时，游离探针也会看不到，何必要看EBNF带。
  4）在把实验图用于文章发表时，需要将EBNF对照带切掉。如果用于发表的图中实验样品都有了结合带，还用得着用EBNF对照来证明EMSA检测系统是否工作吗？！

  四、微奥基因的EMSA对照与价格

  微奥基因所有的阳性与阴性对照的数量与类别为业界最全，所有的阳性与阴性对照都经过EMSA测定，保证品质。现有的阳阴性对照有NFkB，AP1，SP1，OCT1，OCT2，OCT2，NRF2，GATA，STATs，WT-1，EF2，P53，GLI，Burnx1等...