【Pulldown工作原理】

DNA/RNA Pulldown(Pull-down)是一种用于研究核酸与蛋白质相互作用的体外实验技术，是研究基因调控机制的重要工具。其工作原理为；链亲和素磁珠能够与生物素标记的核酸/蛋白复合物结合。 在磁场下或通过离心使结合物与上清液分离，吸弃上清液并洗涤磁珠，然后用解离液使蛋白质变性而与磁珠解离。解离液中的蛋白质可直接通过质谱或通过Western Blotting（WB）进行鉴定。解离液也 可以用SDS PAGE 或双向电泳分离，并用高敏考马斯亮蓝（CBB）染色，从染色胶上切下的蛋白带进行质谱分析（见图1与2）。

【Pulldown实验步骤】

  Pulldownd基本步骤如下：

1. 设计及标记探针：针对目标基因的调控区域设计特异性DNA探针，通常使用脱硫生物素进行标记。
2. 制备样品：依不同实验目的，样品可以是细胞核蛋白、胞浆蛋白、全细胞或菌液、或纯化蛋白。
3. 孵育：将制备的样品液与标记探针共同孵育，使DNA结合蛋白与靶向序列结合，然后与亲和素磁珠孵育，使形成蛋白-核酸-生物素-亲和素磁珠复合物。
4. 纯化和洗涤：通过亲和素磁珠纯化蛋白质-DNA复合物，洗涤去除未结合及非特异性结合的蛋白质。
5. 结合与分离：通过解离液将结合蛋白从复合物解离出来。
6. 蛋白质检测：使用WB 或质谱鉴定与核酸结合的蛋白质类型。

【Pulldown种类】

依据标记探针的结合对象，Pulldown分为直接法与间接法（见相关介绍）：如果标记DNA/RNA探针直接与蛋白结合，对下拉的蛋白进行分析鉴定的实验称为直接Pulldown。标记探针不与蛋白结合，通过与目标DNA/RNA杂交，分析鉴定下拉目标DNA/RNA的结合蛋白的方法称为间接Pulldown。

依据所用探针以及实验目的是用于分析DNA还是RNA结合蛋白，Pulldown可分为DNA Pulldown 与 RNA Pulldown两大类。

直接法Pulldown有两种：1）用已知结合序列的DNA/RNA探针探查相应结合蛋白，检测意义与EMSA相似，可准确确定核酸/蛋白复合物的组分以及结合蛋白家族成员的亚单位。2）用未知或不确定结合序列的DNA/RNA片段探查结合蛋白。用这种Pulldown需要有纯化的DNA/RNA片段并对片段进行标记，需要确定结合蛋白数量与种类，以及蛋白与DNA/RNA的结合序列，变量较多，后期分析工作量大。

间接法Pulldown也分为DNA或RNA Pulldown两类，可用于；1）探测与长链DNA/RNA分子结合的已知或未知蛋白，2）确定与长链DNA/RNA分子结合的多种蛋白成分，3）用于分析与各种非编码RNA（circRNA、lncRNA、eRNA等）或DNA结合的蛋白。

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