A. miRNA测定方法

MicroRNA（miRNA）为长度为18-23个碱基的单链核苷酸，参与细胞增殖、分化和死亡等生物过程，与许多疾病相关并可能成为疾病的生物标志物，为现代生物学与生物医学热门研究领域[9-10]。

人类miRNA已发现有近5千种，以其中的miRNA21为例，在Google学术限定搜索“miR 21”，结果显示有428000篇文献报道（图1）。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字发表的文章应该不少，可见miRNA的研究之热度。

 现已开发了多种检测 miRNA 的技术，包括用放射性标记的探针进行 RNA 印迹分析[11]，基于微阵列[12]和基于聚合酶链式反应(PCR)的方法[13]，液相单细胞测定[14]，原位杂交[15-16]和高通量测序[17]等。然而，这些方法都有其固有的局限性，但是检测 miRNA 依然面临着重大挑战。

Northern印迹法曾经是检测miRNA的，广泛使用标准方法，可以检测miRNA的相对分子大小和丰度，但其也存在低通量、耗时长、易降解等缺点，并且敏感度较低，无法检测到分子量较低的miRNA。

实时定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT- PCR)具有动态范围大、灵敏度高、序列特异性强等优点，已成为检测miRNA表达的常规和可靠技术。 但qRT-PCR测定的miRNA并非样品的实际表达量，难于区分miRNA之间的单核苷酸差异，并且还有假阳性以及引物设计困难的问题。

微阵列技术是一种快速、高通量检测miRNAs的方法，但成本高，不能检测分子量较低的miRNA，对序列相似的miRNA的分辨性不好，也有假阳性问题。

一些学者开发了各种等温分析技术，包括滚环扩增（RCA），指数扩增反应（EXPAR），环介导的等温扩增（LAMP），杂交链反应和催化发夹组装。尽管这些测定具有简单甚至无需仪器操作的优点，但也存在限制其广泛应用的缺点，例如EXPAR和LAMP的非特异性扩增和高背景信号，以及杂交链反应和催化发夹组装的相对较慢的动力学和低灵敏度。

B. miREFA的技术优势

Viagene(微奥基因）公司开发的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是检测miRNA的有力工具，其工作原理是基于分子杂交，未杂交的探针比与RNA/DNA与探针的杂交体的分子量小，导致在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶中移动速度变化，游离探针与杂交体位置不同，探针在电泳胶中的位置通过荧光标记物在荧光扫描仪或成像仪显现。 MiREFA具有以下优势与特点。

1）快速出结果：miREFA技术能够使分子杂交在20分钟内完成，全部测定可以在2小时内完成（图2，时间安排）。

2）灵敏度高：miREFA kits使用近红外标记探针，并采用特殊方法大大提高检测灵敏度，能够测定飞克摩水平的miRNA（图

3）检测灵敏度）。 3.操作简便：miREFA在现有miRNA检测方法中为最简便的操作技术，简单操作与快速出结果能大大降低样品降解（见操作说明书）。

4）分辨率高：miREFA技术能够区分同种miRNA间的单个碱基变异（图4），也能区分miRNA前体与成熟miRNA。

5）绝对量检测：miREFA不涉及任何扩增，所测定的是单位样品体积中的miRNA绝对量。

6）定量检测：miREFA能够对所测定的miRNA进行定量分析。

C. miREFA所需要的条件：

1）近红外荧光标记探针（Viagene的成套试剂已包括，或选用探针定制服务）。

2）近红外荧光探针与样品反应结合液（Viagene的成套试剂已包括）。

3）样品上样液（Viagene的成套试剂已包括）。

4）用于EMSA的预制凝胶板（Viagene产品，选购项）。

5）Li Cor公司近红外荧光扫描仪或任何能够对700nm荧光进行扫描或成像的仪器（客户自备）。

Viagene提供的快速miRNA检测技术涉及多项美国专利与技术秘密。由于时间有限，现仅提供有限类别的miRNA测定Kits，如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144，MiRNA145、MiRNA155的检测。为使客户能够开展其它类别的mRNA检测，现开展为期两个月的优惠活动；凡是我司尚未开发的miRNA检测Kit，客户只需要在成套试剂价格基础上增加600元，我们就可以为客户开发一套针对特定miRNA的测定kit。

Viagene的miRNA测定Kits按标签显示温度存放，可以保存一年。