T许多年来，一直都不是很清楚非编码的长RNA（LncRNA）有什么作用,近几年的研究发现LncRNA（mRNA)在基因调控方面发挥了重要作用。 mRNA疫苗在抗新冠疫情中取得的成功是mRNA作为新型治疗药物的概念兴起，由 mRNA 编码出的抗原决定簇不仅数量众多且类型丰富 [1-3]。与 DNA 药物相比，mRNA 药物不会插入基因组之中 [2-8]，可通过正常代谢途径分解，安全性更高 [5-6]；mRNA 药物无需进入细胞核便可发挥其功能，既可以通过体外转录，也能够在患者体内合成所需的治疗性蛋白质，设计和起效更加灵活快速。 为个性化治疗开辟了新的道路；mRNA 疫苗编码的蛋白可通过激活免疫细胞触发机体免疫反应，可用于癌症免疫治疗、传染病疫苗或蛋白质替代等生物医学和临床医学领域 [7]。目前，针对晚期黑色素瘤的 mRNA 疫苗Ⅰ期临床试验已经完成 [8]。此外，新冠肺炎 mRNA 疫苗的开发与研究也成为近期研究的热点 [2]。 除了作为疫苗抗原的表达模板外，mRNA 药物还具有多种功能。首先，mRNA 可以作为癌症治疗的生物标志物 [9]。mRNA 直接或间接地影响体内细胞变化，发生相应的基因表达，反映组织的病理状态。因此通过检测细胞内 mRNA 的变化，可以为早期疾病的检测提供线索和生理依据。其次，mRNA 动态检测可作为组织检测的有效补充，且在无症状人群中的检测效率较高，可以对多种疾病进行诊断和评估，有潜力替代直接的组织取样检测 [9-10]。 在上述 mRNA 药 物 研 究 过 程 中， 对 体 内 外 mRNA 水平的准确检测能反映基因的表达情况，时刻监测 mRNA 药物的疗效和毒性。因此快速、灵敏、特异性强的 mRNA 检测方法非常重要。常见的 mRNA 检测方法有：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒温扩增技术、细胞成像技术等（见图 1）。 在对mRNA的机理研究或将mRNA作为疾病的生物标志物，准确测定mRNA表达水平非常重要。mRNA的检测技术已发展成为了独立的研究领域，现已开发了多种检测 mRNA 的技术，包括用放射性标记的探针进行 RNA 印迹分析[11]，基于微阵列[12]和基于聚合酶链式反应(PCR)的方法[13]，液相单细胞测定[14]，原位杂交[15-16]和高通量测序[17]等。然而，这些方法都有其固有的局限性，但是检测 mRNA 依然面临着重大挑战。 对 体 内 外 mRNA 水平的准确检测能反映基因的表达情况，时刻监测 mRNA 药物的疗效和毒性。因此快速、灵敏、特异性强的 mRNA 检测方法非常重要。常见的 mRNA 检测方法有：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、恒温扩增技术、细胞成像技术等（见图 1）。。 理想的 mRNA 测定应满足几个要求: 1）灵敏度足够高，能够检测容量很少的样品。2）能够对mRNA 含量进行定量分析。3）特异性强，能够检测 mRNA之间的单核苷酸差异。4）操作简易而不需要昂贵的试剂或设备[18]。5）能够快速出结果。 Northern印迹法曾经是检测mRNA的广泛使用标准，可以检测mRNA的相对分子大小和丰度，但其也存在低通量、耗时长、易降解等缺点，并且敏感度较低，无法检测到分子量较低的mRNA。 实时定量PCR(quantitativereal-timePCR，qRT- PCR)具有动态范围大、灵敏度高、序列特异性强等优点，已成为检测mRNA表达的常规和可靠技术。 但qRT-PCR测定的mRNA并非样品的实际表达量，难于区分mRNA之间的单核苷酸差异，并且还有假阳性以及引物设计困难的问题。 微阵列技术是一种快速、高通量检测mRNAs的方法，但成本高，不能检测分子量较低的mRNA，对序列相似的mRNA的分辨性不好，也有假阳性问题。 为了推进mRNA检测，一些学者开发了各种等温分析技术，包括滚环扩增（RCA），指数扩增反应（EXPAR），环介导的等温扩增（LAMP），杂交链反应和催化发夹组装。尽管这些测定具有简单甚至无需仪器操作的优点，但也存在限制其广泛应用的缺点，例如EXPAR和LAMP的非特异性扩增和高背景信号，以及杂交链反应和催化发夹组装的相对较慢的动力学和低灵敏度。 Viagene 生物技术公司开发的快速messageRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (msREFA) 技术是检测mRNA的有力工具。其工作原理是基于分子杂交，未杂交的探针比与RNA/DNA与探针的杂交体的分子量小，导致在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶中移动速度变化，游离探针与杂交体位置不同，探针在电泳胶中的位置通过荧光标记物在荧光扫描仪或成像仪显现。msREFA具有以下优势与特点。 1.灵敏度高：msREFA kits使用近红外标记探针，并采用特殊方法大大提高检测灵敏度，能够测定飞克摩水平的mRNA（图1，检测灵敏度）。 2.快速出结果：msREFA技术能够使分子杂交在20分钟内完成，mRNA测定在2小时内完成（图2，时间安排）。 3.操作简便：msREFA在现有mRNA检测方法中为最简便的操作技术，简单操作与快速出结果能大大降低样品降解（见操作说明书）。 4.分辨率高：msREFA技术能够区分mRNA前体与成熟mRNA（图3。区分mRNA的分子大小（图4），以及同种mRNA间的单个碱基变异（图5）。 5.绝对量检测：msREFA不涉及任何扩增，所测定的是单位样品体积中的mRNA绝对量。 6.定量检测：msREFA能够对所测定的mRNA进行定量分析。 在新冠病毒的检测中，原位杂交技术也提供了一种快速检测的思路。Wang 等 [36] 基于杂交捕获荧光免疫测定（hybrid capture fluorescence immunoassay，HC-FIA）技术，将杂交和免疫荧光分析结合，开发出了一种新型无需扩增的 SARS-CoV-2 核酸检测平台，能够在 1 h 内完成对 SARS-CoV-2 的检测。首先，在反应管中，优化的 DNA 探针与 SARS-CoV-2 病毒基因组保守的开放阅读框 1ab（ORF1ab）、包膜蛋白（E）和核衣壳（N）区域结合，形成 DNA-RNA 复合物，进而被荧光纳米颗粒标记的 S9.6 抗体捕获；然后，在免疫荧光分析阶段，将 S9.6 抗体以及抗兔IgG 抗体分别喷涂在试纸条的测试线（T）和对照线（C）上，将反应液滴在样品垫上，在毛细管张力的作用下，复合物到达 T 区，被 S9.6 抗体捕获，逐渐产生荧光信号。在 C 区，荧光纳米粒子（fluorescent nanoparticles，FNP）标记的兔 IgG 被抗兔 IgG 捕获，也产生荧光；最后，使用荧光阅读器读取 T/C 荧光值来进行定量分析。相比当前常用的 qPCR 技术，这种新型技术的检测限能达到每毫升 500 拷贝，且已被开发成用于诊断 SARS-CoV-2 的检测试剂盒。