mRNA/lncRNA样品


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  T许多年来,一直都不是很清楚非编码的长RNA(LncRNA)有什么作用,近几年的研究发现LncRNA(mRNA)在基因调控方面发挥了重要作用。 mRNA疫苗在抗新冠疫情中取得的成功是mRNA作为新型治疗药物的概念兴起,由 mRNA 编码出的抗原决定簇不仅数量众多且类型丰富 [1-3]。与 DNA 药物相比,mRNA 药物不会插入基因组之中 [2-8],可通过正常代谢途径分解,安全性更高 [5-6];mRNA 药物无需进入细胞核便可发挥其功能,既可以通过体外转录,也能够在患者体内合成所需的治疗性蛋白质,设计和起效更加灵活快速。为个性化治疗开辟了新的道路;mRNA 疫苗编码的蛋白可通过激活免疫细胞触发机体免疫反应,可用于癌症免疫治疗、传染病疫苗或蛋白质替代等生物医学和临床医学领域 [7]。目前,针对晚期黑色素瘤的 mRNA 疫苗Ⅰ期临床试验已经完成 [8]。此外,新冠肺炎 mRNA 疫苗的开发与研究也成为近期研究的热点 [2]。除了作为疫苗抗原的表达模板外,mRNA 药物还具有多种功能。首先,mRNA 可以作为癌症治疗的生物标志物 [9]。mRNA 直接或间接地影响体内细胞变化,发生相应的基因表达,反映组织的病理状态。因此通过检测细胞内 mRNA 的变化,可以为早期疾病的检测提供线索和生理依据。其次,mRNA 动态检测可作为组织检测的有效补充,且在无症状人群中的检测效率较高,可以对多种疾病进行诊断和评估,有潜力替代直接的组织取样检测 [9-10]。在上述 mRNA 药 物 研 究 过 程 中, 对 体 内 外 mRNA 水平的准确检测能反映基因的表达情况,时刻监测 mRNA 药物的疗效和毒性。因此快速、灵敏、特异性强的 mRNA 检测方法非常重要。常见的 mRNA 检测方法有:逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、恒温扩增技术、细胞成像技术等(见图 1)。在对mRNA的机理研究或将mRNA作为疾病的生物标志物,准确测定mRNA表达水平非常重要。mRNA的检测技术已发展成为了独立的研究领域,现已开发了多种检测 mRNA 的技术,包括用放射性标记的探针进行 RNA 印迹分析[11],基于微阵列[12]和基于聚合酶链式反应(PCR)的方法[13],液相单细胞测定[14],原位杂交[15-16]和高通量测序[17]等。然而,这些方法都有其固有的局限性,但是检测 mRNA 依然面临着重大挑战。对 体 内 外 mRNA 水平的准确检测能反映基因的表达情况,时刻监测 mRNA 药物的疗效和毒性。因此快速、灵敏、特异性强的 mRNA 检测方法非常重要。常见的 mRNA 检测方法有:逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、恒温扩增技术、细胞成像技术等(见图 1)。。理想的 mRNA 测定应满足几个要求: 1)灵敏度足够高,能够检测容量很少的样品。2)能够对mRNA 含量进行定量分析。3)特异性强,能够检测 mRNA之间的单核苷酸差异。4)操作简易而不需要昂贵的试剂或设备[18]。5)能够快速出结果。 Northern印迹法曾经是检测mRNA的广泛使用标准,可以检测mRNA的相对分子大小和丰度,但其也存在低通量、耗时长、易降解等缺点,并且敏感度较低,无法检测到分子量较低的mRNA。实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有动态范围大、灵敏度高、序列特异性强等优点,已成为检测mRNA表达的常规和可靠技术。 但qRT-PCR测定的mRNA并非样品的实际表达量,难于区分mRNA之间的单核苷酸差异,并且还有假阳性以及引物设计困难的问题。微阵列技术是一种快速、高通量检测mRNAs的方法,但成本高,不能检测分子量较低的mRNA,对序列相似的mRNA的分辨性不好,也有假阳性问题。为了推进mRNA检测,一些学者开发了各种等温分析技术,包括滚环扩增(RCA),指数扩增反应(EXPAR),环介导的等温扩增(LAMP),杂交链反应和催化发夹组装。尽管这些测定具有简单甚至无需仪器操作的优点,但也存在限制其广泛应用的缺点,例如EXPAR和LAMP的非特异性扩增和高背景信号,以及杂交链反应和催化发夹组装的相对较慢的动力学和低灵敏度。微奥基因 生物技术公司开发的快速messageRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (msREFA) 技术是检测mRNA的有力工具。其工作原理是基于分子杂交,未杂交的探针比与RNA/DNA与探针的杂交体的分子量小,导致在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶中移动速度变化,游离探针与杂交体位置不同,探针在电泳胶中的位置通过荧光标记物在荧光扫描仪或成像仪显现。msREFA具有以下优势与特点。 1.灵敏度高:msREFA kits使用近红外标记探针,并采用特殊方法大大提高检测灵敏度,能够测定飞克摩水平的mRNA(图1,检测灵敏度)。 2.快速出结果:msREFA技术能够使分子杂交在20分钟内完成,mRNA测定在2小时内完成(图2,时间安排)。 3.操作简便:msREFA在现有mRNA检测方法中为最简便的操作技术,简单操作与快速出结果能大大降低样品降解(见操作说明书)。 4.分辨率高:msREFA技术能够区分mRNA前体与成熟mRNA(图3。区分mRNA的分子大小(图4),以及同种mRNA间的单个碱基变异(图5)。 5.绝对量检测:msREFA不涉及任何扩增,所测定的是单位样品体积中的mRNA绝对量。 6.定量检测:msREFA能够对所测定的mRNA进行定量分析。在新冠病毒的检测中,原位杂交技术也提供了一种快速检测的思路。Wang 等 [36] 基于杂交捕获荧光免疫测定(hybrid capture fluorescence immunoassay,HC-FIA)技术,将杂交和免疫荧光分析结合,开发出了一种新型无需扩增的 SARS-CoV-2 核酸检测平台,能够在 1 h 内完成对 SARS-CoV-2 的检测。首先,在反应管中,优化的 DNA 探针与 SARS-CoV-2 病毒基因组保守的开放阅读框 1ab(ORF1ab)、包膜蛋白(E)和核衣壳(N)区域结合,形成 DNA-RNA 复合物,进而被荧光纳米颗粒标记的 S9.6 抗体捕获;然后,在免疫荧光分析阶段,将 S9.6 抗体以及抗兔IgG 抗体分别喷涂在试纸条的测试线(T)和对照线(C)上,将反应液滴在样品垫上,在毛细管张力的作用下,复合物到达 T 区,被 S9.6 抗体捕获,逐渐产生荧光信号。在 C 区,荧光纳米粒子(fluorescent nanoparticles,FNP)标记的兔 IgG 被抗兔 IgG 捕获,也产生荧光;最后,使用荧光阅读器读取 T/C 荧光值来进行定量分析。相比当前常用的 qPCR 技术,这种新型技术的检测限能达到每毫升 500 拷贝,且已被开发成用于诊断 SARS-CoV-2 的检测试剂盒。

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