miRNA快速检测


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A. miRNA测定方法

MicroRNA(miRNA)为长度为18-23个碱基的单链核苷酸,参与细胞增殖、分化和死亡等生物过程,与许多疾病相关并可能成为疾病的生物标志物,为现代生物学与生物医学热门研究领域[9-10]。

miR21_428000人类miRNA已发现有近5千种,以其中的miRNA21为例,在Google学术限定搜索“miR 21”,结果显示有428000篇文献报道(图1)。相信以“miR21"“miRNA 21”或“miRNA21"名字发表的文章应该不少,可见miRNA的研究之热度。

 现已开发了多种检测 miRNA 的技术,包括用放射性标记的探针进行 RNA 印迹分析[11],基于微阵列[12]和基于聚合酶链式反应(PCR)的方法[13],液相单细胞测定[14],原位杂交[15-16]和高通量测序[17]等。然而,这些方法都有其固有的局限性,但是检测 miRNA 依然面临着重大挑战。

Northern印迹法曾经是检测miRNA的,广泛使用标准方法,可以检测miRNA的相对分子大小和丰度,但其也存在低通量、耗时长、易降解等缺点,并且敏感度较低,无法检测到分子量较低的miRNA。

实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT- PCR)具有动态范围大、灵敏度高、序列特异性强等优点,已成为检测miRNA表达的常规和可靠技术。 但qRT-PCR测定的miRNA并非样品的实际表达量,难于区分miRNA之间的单核苷酸差异,并且还有假阳性以及引物设计困难的问题。 miREFA_timeline

微阵列技术是一种快速、高通量检测miRNAs的方法,但成本高,不能检测分子量较低的miRNA,对序列相似的miRNA的分辨性不好,也有假阳性问题。

一些学者开发了各种等温分析技术,包括滚环扩增(RCA),指数扩增反应(EXPAR),环介导的等温扩增(LAMP),杂交链反应和催化发夹组装。尽管这些测定具有简单甚至无需仪器操作的优点,但也存在限制其广泛应用的缺点,例如EXPAR和LAMP的非特异性扩增和高背景信号,以及杂交链反应和催化发夹组装的相对较慢的动力学和低灵敏度。

B. miREFA的技术优势miREFA_senstvty

微奥基因(微奥基因)公司开发的快速microRNA Electrophoretic Fluorescence Assay (miREFA) 是检测miRNA的有力工具,其工作原理是基于分子杂交,未杂交的探针比与RNA/DNA与探针的杂交体的分子量小,导致在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶中移动速度变化,游离探针与杂交体位置不同,探针在电泳胶中的位置通过荧光标记物在荧光扫描仪或成像仪显现。 MiREFA具有以下优势与特点。

1)快速出结果:miREFA技术能够使分子杂交在20分钟内完成,全部测定可以在2小时内完成(图2,时间安排)。

2)灵敏度高:miREFA kits使用近红外标记探针,并采用特殊方法大大提高检测灵敏度,能够测定飞克摩水平的miRNA(图

3)检测灵敏度)。 3.操作简便:miREFA在现有miRNA检测方法中为最简便的操作技术,简单操作与快速出结果能大大降低样品降解(见操作说明书)。

miREFA_1base_diff4)分辨率高:miREFA技术能够区分同种miRNA间的单个碱基变异(图4),也能区分miRNA前体与成熟miRNA。

5)绝对量检测:miREFA不涉及任何扩增,所测定的是单位样品体积中的miRNA绝对量。

6)定量检测:miREFA能够对所测定的miRNA进行定量分析。

C. miREFA所需要的条件:

1)近红外荧光标记探针(微奥基因的成套试剂已包括,或选用探针定制服务)。

2)近红外荧光探针与样品反应结合液(微奥基因的成套试剂已包括)。

3)样品上样液(微奥基因的成套试剂已包括)。

4)用于EMSA的预制凝胶板(微奥基因产品,选购项)。

5)Li Cor公司近红外荧光扫描仪或任何能够对700nm荧光进行扫描或成像的仪器(客户自备)。

微奥基因提供的快速miRNA检测技术涉及多项美国专利与技术秘密。由于时间有限,现仅提供有限类别的miRNA测定Kits,如Let-7、miRNA21、MiRNA122、MiRNA144,MiRNA145、MiRNA155的检测。为使客户能够开展其它类别的mRNA检测,现开展为期两个月的优惠活动;凡是我司尚未开发的miRNA检测Kit,客户只需要在成套试剂价格基础上增加600元,我们就可以为客户开发一套针对特定miRNA的测定kit。

微奥基因的miRNA测定Kits按标签显示温度存放,可以保存一年。

 

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