【产品包装与价格】

产品类别	目录号	规格	价格	描述
DNA-Prot. Pulldwon	SINP020 SINP021	10次 20次	2995元 4542元	包括DNA Pulldown试剂、结合蛋白分离试剂、凝胶电泳与染色试剂、详细操作说明（随试剂发货）。
RNA-Prot. Pulldwon	SINP022 SINP023	10次 20次	3995元 6592元	包括RNA Pulldown试剂、结合蛋白分离试剂、凝胶电泳与染色试剂、详细操作说明（随试剂发货）。
注：（1）订货须在目录号后加规格。（2）微奥基因还提供DNA-protein与RNA-protein pulldown 服务（查看）。

【工作原理】

DNA-protein Pulldown/Pull-down试剂盒用于从组织与细胞样品中纯化DNA-结合蛋白。其工作原理为；

链亲和素磁珠能够与生物素标记DNA/蛋白复合物结合。在磁场下或通过离心使结合物与上清液分离，吸弃上清液并洗涤磁珠，然后用SDS样品液使蛋白变性而与磁珠分离。分离液中的蛋白质用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或双向电泳分离，SDS PAGE用高灵敏度考马斯亮蓝（CBB）染色。然后从染色胶上切下所需蛋白带进行质谱分析，确认蛋白种类与类型。

主要操作步骤见右边图1与图2。

【产品特点】

1. 结合反应特异性高，非特异结合少。

2. SDS PAGE 染色带清晰、锐利。

3. 染色灵敏度高，可以纯化很少量的DNA结合蛋白（图3）。

4. Pulldown的蛋白适合质谱分析。

【试剂盒组份】

1. 链亲和素磁珠。

2. 生物素标记质控DNA探针。

3. DNA-蛋白或RNA-蛋白结合反应液。

4. DNA或RNA亲和纯化洗液。

5. SDS 样品液。

6. SDS PAGE 预制胶

7. SDS PAGE 染色液。

8. SDS PAGE 脱色液。

9. 操作说明书。

【需要的其它设备与材料】

参考产品使用说明书

【适用范围】

1. 鉴定未知DNA/RNA结合蛋白；在一些情况下（如 Circle-RNA、lncRNA等），可能并不知道与DNA/RNA结合的有哪些蛋白、是些什么蛋白。使用本试剂盒结合质谱分析能够对未知结合蛋白进行鉴定，不需要使用纯化蛋白或抗体。

2. 鉴定DNA结合蛋白的组份；许多转录因子都是多种蛋白的多聚体。例如NFkB有P65，P52，P50，C-rel 和Rel-B 5种亚单位。活化的NFkB为相同或不同亚单位之间的二聚体，鉴定NFkB的亚单位常用Supershift （超迁移）EMSA，需要使用针对各种NFkB亚单位的抗体，价格不菲。使用试剂盒可以NFkB亚单位代替Supershift （超迁移）EMSA 对DNA-蛋白复合物的亚单位进行鉴定，不需使用任何抗体。

3. 鉴定DNA结合蛋白与其它蛋白的相互作用 ；一些转录因子与DNA的结合还需要一些不与DNA结合蛋白的参与。使用本产品能够同时对DNA结合蛋白与非DNA结合蛋白进行鉴定。

【注意事项】

1. 本试剂能够与微奥基因的EMSA成套试剂无缝衔接。但如果使用Thermo，Signosis或碧云天的EMSA试剂，可能达不到理想效果或导致完全失败。其原因是因为不同厂家所用的结合反应液成分不同，不同反应液对同一种转录因子的测定会有明显差异（见图4）。

2. 使用本产品前，建议先进行常规EMSA测定。EMSA测定可以提供以下信息；

1）有没有在EMSA测定中看到DNA与蛋白的结合带。明显的EMSA结合带预示好的鉴定结果。

2）EMSA结合带的强弱提示Pulldown的反应体积；结合带强、样品核蛋白用量少，反应体系体积小。

3）EMSA测定中有没有非特异条带或高背景；如果非特异条带明显，需要使用相同细胞株的阴性对照来确定纯化后的非特异带谱。

3. 请严格按照操作手册进行操作。如果遇到问题，请用生物素标记质控探针与核蛋白样品进行Pulldown 实验。生物素标记质控探针所测定的DNA结合蛋白存在于几乎所有细胞核中，Pulldown的上清液在用考马斯亮蓝染色的PAGE胶中，应会看到为蛋白带。阴性结果提示 1）样品中核蛋白降解核蛋白，2）用于pulldown的核蛋白总量不够，3）样品中的核蛋白浓度太稀，4）核蛋白在提取过程中丢失，提示需要重新制作核蛋白样品并做结合蛋白的EMSA鉴定。

 

 

 

 

 

 

Pic. 3, 20ul、10ul、5ul、2.5 ul、1.25ul 细胞裂解液重复加入SDS PAGE胶。电泳后，凝胶板切成左右两片，分别用微奥基因与Thermo的考马斯亮蓝（CBB）染色。
Pic. 4, 用链亲和素磁珠Pulldwon 的DNA-结合蛋白（电泳道1-5用微奥基因 CBB染色，电泳道6-7用碧*天CBB染色）：1，从EMSA测定阳性的样品pulldown的未知结合蛋白，2，EMSA测定阴性样品的pulldown结果。泳道2使用与泳道1相同细胞株，但细胞没有经过激活处理。3与4，为NFkB EMSA 阳性与阴性样品的pulldown结果。结合质谱分析，能够鉴定NFkB的亚单位。5，蛋白分子Marker。6与7，样品与pulldown操作与泳道3与4相同。Pulldown蛋白经SDS-PAGE分析，用碧*天CBB染色。