Pulldown DNA/RNA

  

【产品包装与价格】

产品类别 目录号 规格 价格 描述
DNA-Prot.
Pulldwon
SIDET301a 10次
3540元
包括DNA结合蛋白Pulldown试剂,结合蛋白分离与凝胶电泳试剂,凝胶染色试剂与详细操作说明书
SIDET301b 20次 5720元
RNA-Prot.
Pulldwon
SIDET302a 10次
4960元
包括RNA结合蛋白Pulldown试剂,结合蛋白分离与凝胶电泳试剂,凝胶染色试剂与详细操作说明书(随试剂发货)。
SIDET302b 20次 7796元
注:(1)订货须在目录号后加规格。(2)Viagene还提供DNA-protein与RNA-protein pulldown 服务(查看)。

DNA_pulldown

【工作原理】

DNA-protein Pulldown/Pull-down试剂盒用于从组织与细胞样品中纯化DNA-结合蛋白。其工作原理为;

链亲和素磁珠能够与生物素标记DNA/蛋白复合物结合。在磁场下或通过离心使结合物与上清液分离,吸弃上清液并洗涤磁珠,然后用SDS样品液使蛋白变性而与磁珠分离。分离液中的蛋白质用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或双向电泳分离,SDS PAGE用高灵敏度考马斯亮蓝(CBB)染色。然后从染色胶上切下所需蛋白带进行质谱分析,确认蛋白种类与类型。

主要操作步骤见右边图1与图2。

【产品特点】

1. 结合反应特异性高,非特异结合少。

2. SDS PAGE 染色带清晰、锐利。

3. 染色灵敏度高,可以纯化很少量的DNA结合蛋白(图3)。

4. Pulldown的蛋白适合质谱分析。

【试剂盒组份】

1. 链亲和素磁珠。

2. 生物素标记质控DNA探针。

3. DNA-蛋白或RNA-蛋白结合反应液。

4. DNA或RNA亲和纯化洗液。

5. SDS 样品液。

6. SDS PAGE 预制胶

pulldown_SDSgel

7. SDS PAGE 染色液。

8. SDS PAGE 脱色液。

9. 操作说明书。

【需要的其它设备与材料】

参考产品使用说明书

【适用范围】

1. 鉴定未知DNA/RNA结合蛋白;在一些情况下,可能并不知道与DNA/RNA结合的有哪些蛋白、是些什么蛋白。使用本试剂盒结合质谱分析能够对未知结合蛋白进行鉴定,不需要使用纯化蛋白或抗体。

2. 鉴定DNA结合蛋白的组份;许多转录因子都是多种蛋白的多聚体。例如NFkB有P65,P52,P50,C-rel 和Rel-B 5种亚单位。活化的NFkB为相同或不同亚单位之间的二聚体,鉴定NFkB的亚单位常用Supershift (超迁移)EMSA,需要使用针对各种NFkB亚单位的抗体,价格不菲。使用试剂盒可以NFkB亚单位代替Supershift (超迁移)EMSA 对DNA-蛋白复合物的亚单位进行鉴定,不需使用任何抗体。

3. 鉴定DNA结合蛋白与其它蛋白的相互作用 ;一些转录因子与DNA的结合还需要一些不与DNA结合蛋白的参与。使用本产品能够同时对DNA结合蛋白与非DNA结合蛋白进行鉴定。

【注意事项】

1. 本试剂能够与Viagene的EMSA成套试剂无缝衔接。但如果使用Thermo,Signosis或碧云天的EMSA试剂,可能达不到理想效果或导致完全失败。其原因是因为不同厂家所用的结合反应液成分不同,不同成分的反应液对同一种转录因子的测定会出现不同结果(见图4)。

2. 使用本产品前,建议先进行常规EMSA测定。EMSA测定可以提供以下信息;

1)有没有在EMSA测定中看到DNA与蛋白的结合带。明显的EMSA结合带预示好的鉴定结果。

2)EMSA结合带的强弱提示Pulldown的反应体积;结合带强、样品核蛋白用量少,反应体系体积小。

3)EMSA测定中有没有非特异条带或高背景;如果非特异条带明显,需要设置各种对照;一般包括相同细胞株的阴性对照空空载体菌株、无探针体系对照以及全蛋白对照等,以确定Pulldown后的特异带谱。

3. 请严格按照操作手册进行操作。如果遇到问题,请用生物素标记质控探针与核蛋白样品进行Pulldown 实验。生物素标记质控探针所测定的DNA结合蛋白存在于几乎所有细胞核中,Pulldown的上清液在用考马斯亮蓝染色的PAGE胶中,应会看到为蛋白带。阴性结果提示 1)样品中核蛋白降解核蛋白,2)用于pulldown的核蛋白总量不够,3)样品中的核蛋白浓度太稀,4)核蛋白在提取过程中丢失,提示需要重新制作核蛋白样品并做结合蛋白的EMSA鉴定。

PAGE_Stain_compare  pulldown_bands

 

 

 

 

 
Pic. 3, 20ul、10ul、5ul、2.5 ul、1.25ul 细胞裂解液重复加入SDS PAGE胶。电泳后,凝胶板切成左右两片,分别用Viagene与Thermo的考马斯亮蓝(CBB)染色。
Pic. 4, 用链亲和素磁珠Pulldwon 的DNA-结合蛋白(电泳道1-5用Viagene CBB染色,电泳道6-7用碧*天CBB染色):1,从EMSA测定阳性的样品pulldown的未知结合蛋白,2,EMSA测定阴性样品的pulldown结果。泳道2使用与泳道1相同细胞株,但细胞没有经过激活处理。3与4,为NFkB EMSA 阳性与阴性样品的pulldown结果。结合质谱分析,能够鉴定NFkB的亚单位。5,蛋白分子Marker。6与7,样品与pulldown操作与泳道3与4相同。Pulldown蛋白经SDS-PAGE分析,用碧*天CBB染色。

  

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