EMSA阴阳对照

  

对照类型 产品描述 目录号 产品包装 价格/元
EMSA-PNEMSA
特异性阴阳性对照 SIDET501a
各6次上样 800
SIDET501b 各10次上样 1250
EMSA-PCEMSA
特异性阳性对照 SIDET502a
6次上样 650
SIDET502b 10次上样 970
EMSA-NCEMSA
特异性阴性对照 SIDET503a 6次上样 330
SIDET503b 10次上样 508

  • 一、为什么需要EMSA阴性阳性对照

  • 通过电泳技术确定目标分子位置时,一般都会放分子量参考物。Western Blotting (WB)使用蛋白分子量Marker,DNA/RNA电泳使用DNA/RNA 分子量Markers 来确定目标分子的位置。 在蛋白与核酸电泳分析中不用Marker会导致无法确认目标分子。同样,在EMSA测定中,不用参照物会造成结果分析困难。

  • EMSA是用非变性胶来分析天然蛋白迁移率。在非变性胶中的蛋白迁移率受许多因素影响;

1)蛋白分子量大的移动慢。但由于EMSA的PAGE 胶浓度很低(相对于WB的浓缩胶),对大蛋白的分离远不及WB。
2)天然蛋白质的3D构型会影响电泳迁移率;小的丝状蛋白可能比分子量大很多的球形蛋白移动慢。
3)蛋白质所带电荷的极性与强弱会影响电泳迁移率; 带负电荷多的移动快。
4)蛋白与蛋白结合会迁移率;如多数转录因子都需与别蛋白结合而发挥作用。
5)蛋白与不同类型探针结合迁移率会有差别。非放射性标记探针的标记物也会影响目标蛋白迁移率。

  • 二、如何制备或获得EMSA对照

  • 做EMSA的目的不是用来判断目标蛋白大小,而是找出核酸/蛋白复合物的位置。因而,在EMSA胶中放分子量Marker没有用,也不能WB的Marker。 一般会在实验时,同时进行EMSA阴性阳性对照的结合反应,一起跑电泳。制备EMSA对照,尤其阳性对照,可以参照文献,采用大家公认的方式进行并且经过EMSA确认。

    以我们做的NFkB对照为例,阳性对照的制备如下;培养Mo7e细胞3天左右,头天放无血清培养基过夜,第二天上午用肿瘤坏死因子(TNF-a)处理1小时,然后抽提核蛋白, 测定蛋白浓度,做NFkB的EMSA分析。阳性样品分装后放-80oC保存。即使这样处理,仍然有25%的几率,NFkB的EMSA结果为阴性,可能与细胞生长有关。

    三、如果选择EMSA对照

    (1)如有可能,尽量选用与实验蛋白因子相同的EMSA对照,有以下好处;1)能够准确指示目标带的位置,2)使用相同探针有助于确定实验条件,3)容易找出EMSA测定中的问题,4)带阴阳对照的图谱可以一起发表。

    (2)当制备与实验蛋白因子相同的对照不易或不可行时,也可采用以结合蛋白位置相近的已知阳性结合蛋白做对照(实际上,WB与核酸电泳中的分子Marker都实验样品不同), 但阳性对照与实验样品的物种来源不要差别太大。对动物与人的许多转录因子而言,阳性结合带都会出现在特定区域,许多都可以互作对照。如果客户对位置判断有问题,Viagene可以协助解决。

    (3)如果阳性对照的结合带位置与EMSA目标分子差别很大,作为阳性对照的意义不大。Thermo公司的Lightshift 中的EBNF阳性对照就没有什么实际意义;

    1)EBNF结合带位置比非特异结合带都低,位于游离探针上面一点,不能帮助判断绝大多数DNA/RNA结合蛋白的位置。
    2)EBNF对照所用探针与样品与实验测定完全不一样。EMSA实验结果未达预期可能是由于核蛋白丢失,蛋白降解,蛋白因子未活化,探针不结合等原因,但与EBNF对照有无结合带出现半毛钱关系都没有。
    3)在同一片胶中用EBNF对照的理由是可确定电泳与测定系统是否工作。理论上,如果跑电泳,转膜,紫外交联,Biotin/Avidin反应,或ECL底物出问题,就可能看不到EBNF结合带。但实际上,出现上述问题时,游离探针也会看不到,何必要看EBNF带。
    4)在把实验图用于文章发表时,需要将EBNF对照带切掉。如果用于发表的图中实验样品都有了结合带,还用得着用EBNF对照来证明EMSA检测系统是否工作吗?!

    四、Viagene的EMSA对照与价格

    Viagene所有的阳性与阴性对照的数量与类别为业界最全,所有的阳性与阴性对照都经过EMSA测定,保证品质。现有的阳阴性对照有NFkB,AP1,SP1,OCT1,OCT2,OCT2,NRF2,GATA,STATs,WT-1,EF2,P53,GLI,Burnx1等...

     

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