快速荧光EMSA

  
传统用放射性同位素标记探针的EMSA需要5到6天出结果,天天都要与射线打交道。基于地高辛标记的非放射性EMSA需要3天左右出结果。

Viagene的生物素标记探针的EMSA测定(湿转膜,查看)可在8小时左右出结果。以后再经过我们科学家改进,生物素标记探针的EMSA(半干转膜,查看)可在4个时左右完成。我公司最新成果使EMSA测定能在2小时左右完成,不仅快,关键是操作非常简单(查看比较几种不同EMSA方法),使之成为远比Western Blot测定磷酸化信号分子或免疫荧光更为简便有效的测定TF的技术。

A.  2小时EMSA的工作原理:

快递EMSA是通过近红荧为分子标记探針完成的,工作原理非常简单:荧光标记探针与转录因子相比分子量相对很小,在电泳中移动快。而荧光探针与转录团子结合的复合物分子量增加10倍以上,电泳移动慢。近红荧光探针在凝胶板中的位置可通过扫描仪确定。

B.  2小时EMSA的优点:

1) 非放射性。

2) 试剂在适当温度可保持一年以上,随时取用。

3) 操作十分简单,整个操作只相当于跑一次垂直板凝胶电泳。

4) 大概2小时出结果。

5) 适合定量分析。

6) RNA EMSA测定的首选方法。

由于以上显著优点,是否EMSA测定方法(同位素法,生物素法以及地高辛法)就应该淘汰呢?答案是否定的,主要有以下限制与问题存在:

C.  2小时EMSA的问题:

1)设备问题。采用荧光标记探针的非放射性EMSA一直有人试,但无法解决灵敏度低的问题。Licor公司开发的近红外荧光技术与相应仪器辉快了长期困扰的灵敏度问题。但Licor公司的近红外扫描仪(Odyssey)需要20多万一台。如果没有Odyssey,用户愿意为了做EMSA购买一台吗?一般来讲,近红外标记探针的EMSA比较适合已经有Odyssey近红外扫描仪的大学与科研院所。

2)探针问题。在已经有Odyssey近红外扫描仪的单位进行近红荧光标记的EMSA还是有相当困难。一是在国内没有任何一家应用LiCor公司的lRDye700/800进行核酸探针的公司。即使使用替代近红外荧光(如CY5.5等)来标记探针,国内外的价格较生物素标记贵近4-5倍。例如,5 OD的探针,DNA合成公司对生物素标记的收费为300-500元/链,地高辛标记400-600元/链。而用CY5.5标记DNA链的价格为1500-2000元/链(生工网上显示收费1500元,宝生物为2200元)。因为EMSA探针为双链,实际合成探针的费用还要X2,再加上合成Olig的费用。仅仅合成带近红荧光寡核苷酸的费用就在4000元左右,还不包括后面双链制作,纯化以及比活性测定。这样的费用使一些用户望而却步,宁可采用相对较便宜的生物素(化学发光)标记探针的EMSA。

3)由于近红外荧光标记物的松散的化学结构(比较结构的差别)。标记的探针很容易产生聚积而不进胶,使结合信号变弱。在国外,有不少用户自己合成近红外荧光探针但都因为探针聚积问题而放弃了。Li-Cor公司的解决方法是改用4-20%的梯度胶。即使这样,NFKB的EMSA结果仍显示在上样孔有明显的探针聚积(查看Li-Cor用4-12%凝胶电泳的NFkB图谱)。

D.  Vingene所解决的技术难题:

1)发展了近红外荧光探针标记的新技术,使近红外探针的价格大幅降低,到达与其它非NrF2_2hrEMSA放射性探针相近的价位。

2)比较好的解决了探针聚积问题,使结果更清晰、漂亮。

E.  2小时EMSA所需要的条件:

1)近红外荧光标记探针(Viagene的成套试剂已包括,或选用Viagene的探针定制服务)。

2)近红外荧光探针与样品反应结合液(Viagene的成套试剂已包括)。

3)样品上样液(Viagene的成套试剂已包括)。

4)用于EMSA的预制凝胶板(Viagene产品,选购项)。

5)Li Cor的近红外荧光扫描仪或任何能够对700nm荧光进行扫描仪器(客户自备)。
 

 

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